Этиленгликоль как криопротектор
Сферы применения этиленгликоля настолько многообразны, что о его значении для современной криобиологии вспоминают сравнительно нечасто. Мы восполняем пробел и рассказываем, чем этот двухатомный спирт ценен для продвинутой медицины и животноводства.
Спасительный холод и его помощники
Вещества, способные защитить живые клетки от гибели при замораживании, называют криопротекторами – буквально «защитниками от холода».
Идея заморозить клетку, чтобы сохранить ее, а потом «разбудить» живой, не нова. Еще в XVIII веке ученые во время опытов заметили, что охлажденные сперматозоиды после оттаивания вновь приходили в движение. Однако прорыв случился в 1949 году: британские исследователи обнаружили, что глицерин спасает сперматозоиды от разрушения при замораживании в жидком азоте. Их открытие положило начало современной криобиологии – науке о том, как сохранять живое при экстремально низких температурах.
Так в чем же ценность сохранения клеток в холоде?
Дело в том, что при температуре минус 196 °C – точке кипения жидкого азота – все химические реакции в клетке останавливаются. Клетка как бы впадает в анабиоз: не стареет, не разрушается, может храниться десятилетиями. Благодаря этому стали возможны банки донорской крови, оплодотворение в пробирке (ЭКО), сохранение спермы ценных пород скота и даже заморозка эмбрионов животных.
Но заморозить клетку без повреждения – задача нетривиальная. Главная проблема тут – лед. Когда вода превращается в кристаллы, их грани рвут клеточные оболочки. Кроме того, при замерзании вода уходит в лед, а соли остаются в растворе – клетка страдает от «соленого стресса», теряя влагу и деформируясь.
Именно здесь в дело вступают специальные вещества – криопротекторы. Они смешиваются с клеточной жидкостью и мешают молекулам воды выстраиваться в кристаллы. Некоторые из них проникают внутрь клетки через оболочку – это проникающие криопротекторы, к ним относятся глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и этиленгликоль (ЭГ). Сахароза и трегалоза работают только снаружи, вытягивая лишнюю воду из клетки осмотически.
Считается, что ЭГ среди проникающих криопротекторов – самый легкий, он быстрее других проходит через клеточную оболочку. При достаточной концентрации раствор с ЭГ не замерзает в привычном смысле, а переходит в стеклоподобное состояние.
Что до токсичности: на уровне организма этиленгликоль ядовит, но при криоконсервации важно другое – насколько вещество вредит самой клетке до и после заморозки. И по этому показателю – цитотоксичности – ЭГ выгодно отличается от аналогов: он меньше повреждает мембраны и белки. После разморозки криопротектор отмывают – и клетка готова к работе.
Эти свойства сделали ЭГ стандартом для заморозки яйцеклеток и эмбрионов –
самых нежных клеток, где цена ошибки максимальна.
ЭГ как криопротектор в медицине
Главное применение этиленгликоля в качестве криопротектора – репродуктивная медицина. В конце 1990-х годов переход на ЭГ в протоколах заморозки эмбрионов привел к скачку результативности ЭКО. Сегодня сверхбыстрая заморозка (витрификация) стала основным методом: выживаемость эмбрионов после нее достигает 94% против 88% при обычном замораживании. Эмбрион помещают в раствор ЭГ на 10–15 минут – криопротектор вытесняет воду из клеток, затем раствор дополняют сахарозой, которая работает снаружи, и за секунды охлаждают до -196 °C.
Вторая область применения – стволовые клетки. Ранее стандартом был ДМСО, однако при температурах выше 4 °C он повреждает клетки даже в малых концентрациях и распадается с образованием диметилсульфида с резким запахом. ЭГ в комбинации с сахарозой и другими компонентами становится основой создания безопасных сред для заморозки стволовых клеток. Запатентованные растворы на основе ЭГ обеспечивают выживаемость клеток до 92% и без единой капли ДМСО.
Третье направление – ткани и органы. Для их витрификации требуются концентрации криопротекторов до 70%, что само по себе токсично. Поэтому ЭГ используют в составе сложных смесей – с ДМСО, сахарозой и другими веществами, где каждый компонент снижает долю остальных.
Общая проблема всех применений – отмывка. После разморозки криопротектор нужно убрать, иначе его токсичность проявится уже при комнатной температуре. Чем эффективнее криопротектор – тем выше его концентрация в клетке и тем сложнее его вывести. Это ограничение и задает направление дальнейшим разработкам.
ЭГ как криопротектор в агросекторе
Основным потребителем криопротекторов в сельском хозяйстве выступает животноводство. Для заморозки эмбрионов коров сегодня чаще всего используют раствор ЭГ с добавлением сахарозы. Эта комбинация дает выживаемость эмбрионов 93–96% после разморозки и приживаемость 59–62% после переноса корове-реципиенту.
ЭГ входит в состав криозащитных сред и для спермы быков, баранов, козлов. Здесь он конкурирует с глицерином, который десятилетиями был стандартом, но ЭГ все чаще включают в составы именно из-за быстрой диффузии – сперматозоиды меньше страдают от длительной экспозиции.
Перспективная ниша для применения веществ-криопротекторов –
аквакультура. Исследования российских и казахских ученых показали, что для спермы карпа 10% раствор ЭГ оказался на эффективнее, чем ДМСО. Для рыбоводных хозяйств это значит больший выход малька при тех же затратах.
ЭГ применяют и для заморозки семян. Концентрации 5–15% обеспечивают приемлемую всхожесть семян некоторых лекарственных растений после хранения в жидком азоте. Подобные растворы – это эффективный инструмент для банков генетического разнообразия и сохранения редких видов.
Криобанки генетического материала скота позволяют сохранять ценные породы, перевозить генетику по всему миру в соломинках с жидким азотом, снижать затраты на содержание племенного поголовья.
ЭГ и перспективы криопротекторов
Главным минусом ЭГ в качестве криопротектор остается токсичность. Даже если криопротектор быстро отмывают после разморозки, сам процесс отмывки – это стресс для клеток. В криобиологии ищут альтернативы, которые дают такой же надежный результат, но проще и безопаснее в работе.
Один из трендов – смеси криопротекторов. Вместо одного «сильного» компонента берут несколько в меньших концентрациях: ЭГ + сахароза + трегалоза, или ЭГ + ДМСО + формамид. Так удается снизить долю каждого токсичного вещества и сохранить высокую выживаемость клеток.
Еще одно перспективное направление – непроникающие криопротекторы. Трегалоза и некоторые полисахариды работают снаружи клетки: вытягивают лишнюю воду и стабилизируют мембраны, не проникая внутрь. Это снижает необходимость в токсичных проникающих веществах. В опытах с эмбрионами трегалоза в комбинации с низкими дозами ЭГ позволила добиться сопоставимой выживаемости при уменьшенной общей токсичности раствора.
Наконец, ученые смотрят в сторону «умных» сред и новых технологий. Например, разрабатывают растворы с наночастицами, которые помогают равномерно охлаждать образец и уменьшают образование кристаллов.
При этом о полном отказе от ЭГ речь пока не идет, скорее всего, ближайшие годы пройдут под знаком гибридных решений и ЭГ останется «рабочей лошадкой» заморозки, но его будут использовать в более сбалансированных составах.
В целом ЭГ остается одним из основных криопротекторов в криобиологии. Его высокая проницаемость и способность подавлять образование льда делают его незаменимым для сохранения чувствительных биологических материалов методом витрификации. Он по-прежнему играет ключевую роль в развитии науки о низкотемпературном хранении биоматериалов.
